<s>转录组_n 测_v 序_Ng 技术_n 的_u 研究_vn 和_c 应用_vn 进展_vn</s>
<s>崔凯_nr 吴伟伟_nr 刁其玉_nr</s>
<s>中国_ns 农业_n 科学院_n 饲料_n 研究所_n 农业部_nt 生物_n 饲料_n 重点_n 实验室_n 新疆_ns 畜牧_n 科学院_n 畜牧_n 研究所_n</s>
<s>生物_n 技术_n 通报_vn 2019_m (_w 07_m )_w</s>

<s>摘要_n ：_w 转录_vn 组_n (_w Transcriptome_nx )_w 是_v 指_v 特定_b 细胞_n 或_c 组织_n 中_f 全部_m 转录_vn 产物_n ,_w 包括_v 信使_v RNA_nx ,_w 核糖_n 体_n RNA_nx 、_w 转运_vn RNA_nx 以及_c 非_h 编码_n RNA_nx 。_w</s><s>高_a 通_j 量_vn 测_v 序_Ng 技术_n 的_u 快速_b 发展_vn ,_w 为_p 从_p 整体_n 水平_n 系统_a 地_u 研究_v 转录_vn 组_n 学_n 研究_vn 提供_v 快捷_z 可靠_a 的_u 平台_n 。_w</s><s>综述_v 了_u 当前_t 主流_b 的_u 高_a 通_n 量_n 测_v 序_n 技术_n 及其_c 在_p 转录_n 组_n 学_n 研究_vn 中_f 的_u 应用_vn ,_w 并_c 讨论_v 了_u 转录_n 组_n 数据_n 分析_vn 中_f 一些_m 值得_v 关注_v 的_u 问题_n ,_w 以及_c 转录_n 组_n 测_v 序_n 技术_n 在_p 生物学_n 研究_vn 中_f 的_u 应用_vn 方向_n 。_w</s>
<s>基金_n ：_w 国家_n 自然_l 科学_l 青年_n 科学_n 基金_n 项目_n (_w 31802088_m )_w</s>
<s>关键_n 词_n ：_w 转录组_n ;_w RNA_nx -_w seq_nx ;_w 二_m 代_q 测_v 序_n ;_w 三_m 代_q 测_v 序_n ;_w 单细胞_b 转录组_n</s>
<s>作者_n 简介_n ：_w 崔凯_nr ,_w 男_b ,_w 副研究员_n ,_w 研究_vn 方向_n :_w 分子_n 营养_n 与_c 表观_n 遗传学_n ,_w E-mail_nx :_w cuikai_nx @_w caas_nx .cn_n ;_w *_w 刁其玉_nr ,_w 男_b ,_w 研究员_n ,_w 博士生_n 导师_n ,_w 研究_vn 方向_n :_w 反刍_vn 动物_n 营养_n ,_w E-mail_nx :_w diaoqiyu_nx @_w caas.cn_nx ;_w</s>
<s>收_v 稿_Ng 日期_n ：_w 2019-04-28_m</s>

<s>转录_vn 组_n 学_n 是_v 从_p 整体_n 转录_vn 水平_n 系统_ad 研究_v 基因_n 转录_vn 图谱_n 并_c 揭示_v 复杂_a 生物学_n 通路_n 和_c 性状_n 调控_vn 网络_n 分子_n 机制_n 的_u 学科_n 。_w</s><s>在_p 高_a 通_j 量_n 测_v 序_n 技术_n 发展_v 以前_f ，_w 基于_p cDNA_nx 杂交_vn 荧光_n 检测_v 的_u 高_a 通_j 量_n 基因_n 表达_vn 芯片_n （_w Expression_nx array_nx ）_w 和_c 基因_n 表达_vn 系列_n 分析_vn 技术_n （_w Serial_nx analysis_nx of_c gene_nx expression_nx ,_w SAGE_nx ）_w 是_v 从_p 整体_n 水平_n 研究_v 动植物_j 组织_n 中_f 基因_n 表达_vn 信息_n 的_u 主要_b 手段_n 。_w</s>
<s>在_p 2008_m 年前_t 后_f ，_w 高_a 通_n 量_n 测_v 序_n 技术_n 开始_v 应用_v 于_p 细胞_n 和_c 组织_n 中_f 转录_vn 本_n （_w 主要_d 是_v m_nx RNA_nx ）_w 的_u 种类_n 和_c 表达_vn 量_n 的_u 研究_vn ，_w 转录_vn 组_n 测_v 序_n （_w RNA_nx sequencing_nx ,_w RNA_nx -_w seq_nx ）_w 这样_r 的_u 名词_n 开始_v 出现_v 并_c 被_p 广泛_ad 应用_v [_w 1_m ]_w 。_w</s><s>与_p 基因_n 表达_vn 芯片_n 方法_n 不同_a ，_w RNA_nx -_w Seq_nx 不仅_c 能够_v 检测_v 与_p 现有_vn 基因_n 组_n 序列_n 相_d 对应_v 的_u 转录_n 本_n ，_w 并_c 能_v 发现_v 和_c 定量_v 新_a 的_u 转录_n 本_n ，_w 对_p 选择性_n 剪接_vn 事件_n 、_w 新_a 基因_n 和_c 转录_vn 本_n 以及_c 融合_vn 转录_vn 本_n 的_u 研究_vn 更_d 具_Vg 优势_n ，_w 从而_c 能_v 更加_d 系统_a 地_u 研究_v 转录_vn 组_n 学_n 。_w</s><s>2010_m 年_n 前后_f ，_w 三_m 代_q 测_v 序_n 技术_n （_w 单_b 分子_n 测_v 序_n 技术_n ）_w 兴起_v ，_w 因_c 其_r 具有_v 测_v 序_n 读_v 长_a 较_d 长_a 的_u 优点_n ，_w 在_p 研究_v 全长_n 转录本_n 上_f 具有_v 二_m 代_q 测_v 序_n 短_a reads_nx 所_u 不_d 能_v 达到_v 的_u 优势_n 。_w</s>
<s>随着_p 测_v 序_n 技术_n 的_u 发展_vn 和_c 成本_n 的_u 降低_vn ，_w 使得_v 核酸_n 的_u 检测_vn 与_c 定量_vn 更加_d 便捷_a 和_c 准确_a ，_w 高_a 通_n 量_n 测_v 序_n 在_p 转录_vn 组_n 学_n 的_u 研究_vn 上_f 越来越_d 普遍_a ，_w 大_d 有_v 替代_v 基因_n 表达_vn 芯片_n 的_u 趋势_n 。_w</s><s>运用_v 现有_v 的_u 转录_vn 组_n 研究_vn 手段_n 系统_a 、_w 准确_a 地_u 探究_v 从_p DNA_nx 向_p RNA_nx 转录_v 这_r 一_m 复杂_a 而_c 精细_a 的_u 调控_vn 层次_n ，_w 是_v 揭示_v 生物学_n 过程_n 中_f 的_u 复杂_a 性状_n 和_c 解析_v 转录_vn 调控_vn 网络_n 的_u 重要_a 方面_n 。_w</s>
<s>1_m 高_a 通_j 量_n 测_v 序_Ng 平台_n</s>
<s>1.1_m 二_m 代_q 测_v 序_Ng 平台_n</s>
<s>20_m 世纪_n 70_m 年代_n ，_w 第一_m 代_q 测_v 序_n 技术_n （_w Sanger_n 双_m 脱氧_vn 测_v 序_n 技术_n ）_w 的_u 出现_vn ，_w 实现_v 了_u 对_p 核酸_n 序列_n 进行_v 测_v 序_n 。_w</s><s>但_c Sanger_nx 测_v 序_n 法_n 的_u 通_n 量_n 较_d 低_a ，_w 不_d 能_v 满足_v 大批量_m 测_v 序_n 的_u 要求_n ，_w 难以_d 应用_v 在_p 组_n 学_n 测_v 序_n 的_u 研究_vn 中_f 。_w</s><s>后来_t 发展_v 的_u 高_a 通_j 量_n 测_v 序_n （_w High_a -_w throughput_nx sequencing_nx ）_w 技术_n ，_w 即_v 二_m 代_q 测_v 序_n （_w Next_nx generation_nx sequencing_nx ,_w NGS_nx ）_w 技术_n ，_w 实现_v 了_u 测_v 序_n 的_u 高_a 通_j 量_n 和_c 自动化_vn ，_w 加速_v 了_u 转录_vn 组_n 学_n 研究_vn 的_u 快速_b 发展_vn 。_w</s><s>目前_t ，_w 二_m 代_q 测_v 序_n 平台_n 主要_d 包括_v 454Life_nx Sciences_nx 公司_n 推出_v 的_u 454_m 测_v 序_n 技术_n 、_w Illumina_nx 公司_n 和_c ABI_nx 公司_n 相继_d 推出_v 的_u Solexa_nx 和_c SOLID_nx 测_v 序_n 技术_n 等_u ，_w 其中_r 454_m 测_v 序_n 技术_n 平台_n 最_d 早_a 实现_v 商业化_v 。_w</s><s>在_p 过去_t 10_m 年间_n ，_w Illumina_nx 公司_n 的_u Solexa_nx 技术_n ，_w 即_v 边_d 合成_v 边_d 测_v 序_n （_w Sequencing_nx by_nx synthesis_nx ,_w SBS_nx ）_w 技术_n 发展_v 迅速_a ，_w 其_r HiSeq_nx 系列_n 的_u 测_v 序_n 平台_n 逐渐_d 成为_v 二_m 代_q 测_v 序_n 技术_n 中_f 最_d 被_p 广泛_ad 应用_v 的_u 平台_n 。_w</s><s>Illumina_nx /_w Solexa_nx 的_u 测_v 序_n 平台_n 主要_d 是_v 采用_v 边_d 合成_v 边_d 测_v 序_n （_w SBS_nx ）_w 的_u 方法_n ，_w 此_r 种_q 方法_n 是_v 将_p 提取_v 的_u 核酸_n 片段_n 打断_v 到_v 几百_m bp_q 大小_n 后_f ，_w 加上_v 接头_n 和_c 测_v 序_n 引_v 物_Ng 等_u 序列_n ，_w 经_p PCR_nx 扩_Vg 增_v 后_f 建成_v library_nx ，_w 在_p 含有_v 接头_n 序列_n 的_u 芯片_n （_w Flow_nx cell_nx ）_w 上_f 对_p 文库_n 进行_v 反应_vn ，_w 每_r 个_q 反应_vn 循环_vn 中_f ，_w 标记_v 4_m 种_q 荧光_n 染料_n 的_u 碱基_n 通过_p 互补_vn 碱_n 基_Ng 配对_v 被_p 加入_v 到_v 单_b 分子_n 的_u 合成_vn 中_f ，_w 这样_r 通过_p CCD_nx 采集_v 序列_n 上_f 的_u 荧光_n 信号_n ，_w 读取_v 测_v 序_n 片段_n 的_u 碱_n 基_n 序列_n 。_w</s><s>Illumina_nx 现有_v 桌面式_b 和_c 生产_vn 规模_n 式_k 两_m 大_a 类_q 测_v 序_Ng 平台_n （_w 表_n 1_m ）_w ，_w 可以_v 满足_v 中_f 小_a 实验室_n 以及_c 大_a 规模_n 平台_n 的_u 二_m 代_q 测_v 序_n 需求_n 。_w</s>
<s>1.2_m 三_m 代_q 测_v 序_Ng 平台_n</s>
<s>三_m 代_q 测_v 序_n 技术_n 也_d 叫_v 单_b 分子_n 测_v 序_n 技术_n （_w Single_nx molecule_nx sequencing_nx ）_w ，_w 具有_v 超_d 长_b 读_v 长_a （_w 平均_a 读_v 长_a 10_m -_w 15_m kb_q ，_w 最_d 长_a 读_v 长_a 可达_v 60_m kb_q ）_w 、_w 无_v PCR_nx 扩_Vg 增_vn 偏向_vn 性_n 及_c GC_nx 偏好_n 性_n 的_u 特点_n ，_w 被_p 认为_v 是_v 进行_v 全_a 基因_n 组_n de_nx nove_nx 组装_vn 、_w 全长_n 转录_vn 本_n 测_v 序_n 及_c 表_n 观_n 遗传学_n 测_v 序_n 的_u 理想_a 测_v 序_n 平台_n 。_w</s><s>PacBio_nx 公司_n 的_u 单_b 分子_n 实时_n 测_v 序_n 技术_n （_w Single_nx molecule_nx real_a time_nx sequencing_nx ,_w SMRT_nx -_w seq_nx ）_w [_w 2_m ]_w 和_c Oxford_nz Nanopore_nx Technologies_n 的_u 纳米_n 孔_n 单_b 分子_n 测_v 序_n 平台_n [_w 3_m ]_w 是_v 目前_t 主流_n 的_u 三_m 代_q 测_v 序_n 平台_n 。_w</s><s>由于_c 三_m 代_q 测_v 序_n 技术_n 由于_c 在_p 测_v 序_n 时_Ng 没有_d 经过_p 模板_n 扩_vn 增_vn ，_w 测_v 序_n 信号_n 的_u 检测_vn 相对于_v 边_d 合成_v 边_d 测_v 序_n 的_u 二_m 代_q 测_v 序_n 技术_n 较_d 弱_a ，_w 容易_a 在_p 碱_n 基_Ng 识别_vn 时_Ng 产生_v 随机_b 错误_n 。_w</s><s>因而_c PacBio_nx 平台_n 的_u 设计_vn 是_v 对_p 核酸_n 分子_n 进行_v 环_n 化_vn 测_v 序_n （_w Circular_nx consensus_nx sequencing_nx ,_w CCS_nx ）_w ，_w 反复_d 读取_v reads_nx 后_f 对_p 碱_n 基_n 序列_n 进行_v 迭_vn 代_vn 校正_vn ，_w 从而_c 有效_ad 提高_v 了_u 单_b 分子_n 测_v 序_n 的_u 准确性_n [_w 2_m ]_w 。_w</s><s>目前_t ，_w PacBio_nx 公司_n 推出_v 的_u SequelⅡ_nx 测序_vn 平台_n ，_w 长_a 序列_n reads_nx 的_u 读取_vn 精确_an 得到_v 进一步_b 提升_vn ，_w 平均_a 读长_n 13.5_m kb_q 的_u 长_a 序列_n reads_nx 的_u 读取_vn 精度_n 可_v 达_v 99.8%_m [_w 4_m ]_w 。_w</s>
<s>表_n 1_m 几_m 种_q 主要_b 测_v 序_n 平台_n 特点_n</s>
<s>(_w https://www.illumina.com.cn/systems/sequencing-platforms.html_nx )_w</s>
<s>2_m 转录_n 组_n 测_v 序_n</s>
<s>转录_vn 组_n 测_v 序_n （_w RNA_nx -_w seq_nx ）_w 就_d 是_v 利用_v 高_a 通_b 量_n 测_v 序_n 技术_n 将_p 细胞_n 或_c 组织_n 中_f 全部_m 或_c 部分_m m_nx RNA_nx 、_w small_nx RNA_nx 和_c no_nx -_w codingRNA_nx 进行_v 测_v 序_n 分析_vn 的_u 技术_n 。_w</s><s>转录组_n 测_v 序_n 和_c 分析_v 一般_a 流程_n 如_v 图_n 1_m 所_u 示_Vg 。_w</s><s>目前_t 最_d 常见_a 的_u 转录_vn 组_n 测_v 序_n 是_v 基于_p 二_m 代_q 测_v 序_n 技术_n ，_w 以_p Illumina_nx 的_u NGS_nx 测_v 序_n 平台_n 为_v 主流_n 。_w</s><s>这_r 种_q 方法_n 需要_v 根据_p 实验_vn 目的_n 对_p RNA_nx 样本_n 进行_v 处理_vn ，_w 将_p mRNA_nx ,_w miRNA_nx ,_w lncRNA_nx 其中_r 的_u 部分_m 或_c 全部_m 反_d 转_v 录成_v cDNA_nx 文库_n ，_w 再_d 利用_v 高_a 通_n 量_n 测_v 序_n 平台_n 进行_v 测_v 序_vn [_w 1_m ,_w 5_m ]_w 。_w</s><s>通常_d 会_v 根据_p 测_v 序_n 对象_n 长度_n 的_u 不同_an ，_w 在_p 测_v 序_n 建_v 库_n 的_u 时候_n 会_v 选择_v 建立_v 不同_a 大小_n 片段_n 的_u 文库_n 。_w</s><s>一般_a 地_u ，_w 进行_v mRNA_nx 测_v 序_n ，_w 建_v 库_n 时_Ng 通常_d 建立_v 几百_m bp_q 大小_a 片段_n 的_u 文库_n ，_w 选择_v 双向_d 测_v 序_n 较_d 多_a ；_w 进行_v miRNA_nx 测_v 序_n 时_Ng ，_w 通常_d 将_p miRNA_nx 进行_v 分离_vn ，_w 单独_d 建立_v 小_a 片段_n 文库_n 后_f 再_d 进行_v 单向_b 测_v 序_n ；_w 而_c 长_a 链_Ng 非_h 编码_n RNA_nx (_w long_a non_nx -_w coding_nx RNA_nx ,_w lncRNA_nx ）_w 存在_v 正向_b 转录_n 和_c 反向_b 转录_n ，_w 所以_c 常_d 采用_v 链_Ng 特异_Ag 性_n 建_v 库_n 测_v 序_n 。_w</s>
<s>图_n 1_m 转录_n 组_n 测_v 序_n 和_c 分析_vn 流程_n 示意图_n</s>
<s>2.1_m mRNA_nx 测_v 序_n</s>
<s>对于_p mRNA_nx 测_v 序_n ，_w 利用_v mRNA_nx 在_p 3_m '_w 端_n 具有_v poly_nx -_w A_nx 的_u 结构_n 特点_n ，_w 富_v 集_v 出_v 特定_b 组织_n 或_c 细胞_n 在_p 特定_b 时空_n 条件_n 下_f 转录_v 出来_v 的_u 不_d 含_v 内含_n 子_n 序列_n 的_u m_nx RNA_nx 分子_n ，_w 反_d 转录_v 成_v cDNA_nx 建_v 库_n 测_v 序_n 。_w</s><s>根据_p 测_v 序_n 得到_v 的_u m_nx RNA_nx 序列_n ，_w 可以_v 精确_a 地_u 比对_v 至_v 参考_vn 基因_n 组_n 序列_n 上_f ，_w 从而_c 判断_v 外显_n 子_n 与_c 内含_n 子_n 的_u 边界_n 。_w</s><s>对于_p 无_v 参考_vn 基因_n 组_n 的_u 物种_n ，_w 通过_p 对_p 序列_n 进行_v 从_p 头_n 拼接_vn （_w de_nx nove_nx assembly_nx ）_w ，_w 得到_v 转录_v 本_r 具体_a 的_u 序列_n 信息_n 。_w</s><s>通过_p 对_p 不同_a 物种_n 、_w 不同_a 发育_vn 阶段_n 的_u 不同_a 组织_n 中_f 的_u 转录_n 组_n 进行_v 研究_vn ，_w 可以_v 发现_v 基因_n 转录_vn 的_u 物种_n 特异_n 性_n 和_c 时空_n 差异_n 的_u 特点_n ，_w 为_p 深入_ad 理解_v 物种_n 和_c 性状_n 的_u 分子_n 机理_n 提供_v 转录_n 组_n 水平_n 的_u 线索_n 。_w</s>
<s>2_m ._w 2_m small_nx RNA_nx 测_v 序_n</s>
<s>Small_nx RNA_nx 是_v 指_v 长度_n 在_p 20_m -_w 50_m nt_nx 的_u RNA_nx 分子_n ，_w 包括_v miRNA_nx 、_w siRNA_nx 、_w snoRNA_nx 和_c piRNA_nx 等_u ，_w 通过_p 参与_v m_nx RNA_nx 降解_vn 、_w 抑制_v 翻译_vn 过程_n 、_w 促进_v 异_Ag 染色_n 质_n 形成_vn 和_c DNA_nx 表_n 观_n 修饰_vn 等_u 多_a 种_q 途径_n 来_v 调控_v 生物学_n 过程_n 。_w</s><s>根据_p small_nx RNA_nx 的_u 5_m '_w 端_Ng 磷酸基_n 和_c 3_m '_w 端_Ng 羟基_n 的_u 结构_n 特点_n ，_w 链接_vn 测_v 序_n 接头_n 并_c 筛选_v small_nx RNA_n 测_v 序_n 文库_n 进行_v 测_v 序_n 。_w</s><s>miRNA_nx 在_p 物种_n 间_f 的_u 生物学_n 功能_n 较为_d 保守_a ，_w 是_v small_nx RNA_nx 测_v 序_n 研究_vn 中_f 的_u 重点_n 。_w</s><s>Hutvagner_nx 等_u [_w 6_m ]_w 通过_v small_nx RNA_nx 测_v 序_n 鉴定_vn 得到_v miRNA_nx let_nx -_w 7_m ，_w 通过_v 与_p m_nx RNA_nx 不_d 完全_ad 匹配_v 发挥_v 抑制_v 翻译_v 的_u 作用_n 。_w</s>
<s>2.3_m lncRNA_nx 测_v 序_n</s>
<s>长_a 链_n 非_h 编码_n RNA_nx (_w lncRNA_nx ）_w 是_v 一_m 类_q 长度_n 在_p 200_m nt_nx 以上_f 、_w 无_v 编码_n 蛋白质_n 功能_n 的_u RNA_nx 分子_n ，_w 往往_d 具有_v 很_d 强_a 的_u 物种_n 、_w 组织_n 特异_Ag 性_n 。_w</s><s>部分_m lncRNA_nx 位于_v 基因_n 的_u 增强_vn 子_n 区域_n ，_w 通过_p 自身_r 的_u 转录_vn 而_c 实现_v 增强_v 子_Ng 的_u 功能_n [_w 7_m ]_w 。_w</s><s>lncRNA_nx 调控_vn 方式_n 多样_m 且_c 广泛_ad 存在_v 于_p 各_r 类_q 动植物_j 细胞_n 中_f ，_w 可以_v 通过_p 参与_v 染色体_n 结构_n 形成_vn 以及_c 与_p 转录_vn 因子_n 、_w 蛋白质_n 、_w RNA_nx 前_f 体_n 、_w miRNA_nx 结合_v 等_u 多_a 种_q 方式_n 调节_v 各_r 类_q 生物学_n 分子_n 的_u 功能_n 。_w</s><s>部分_n lncRNA_nx 含有_v ploy_nx -_w A_nx 尾_Ng 结构_n ，_w 因而_c 在_p m_nx RNA_nx 的_u 测_v 序_n 结果_n 中_f 往往_d 包含_v 部分_n lncRNA_nx 序列_n 信息_n 。_w</s><s>目前_t 对于_p lncRNA_nx 的_u 研究_vn ，_w 以_p 寻找_v 差异_n 表达_vn 的_u lncRNA_nx 分子_n 入手_v ，_w 主要_d 依据_p lncRNA_nx 与_p 关键_a 编码_n 基因_n 的_u 位置_n 关系_n ，_w 进一步_d 预测_v 两_m 者_r 之间_f 的_u 调控_vn 关系_n 。_w</s>
<s>2.4_m circRNA_nx 测_v 序_Ng</s>
<s>环状_n RNA_nx (_w circRNA_nx ）_w 具有_v 特殊_a 的_u 稳定性_n 良好_a 的_u 成_v 环_n 结构_n ，_w 不_d 容易_a 被_p RNA_nx 酶_n 降解_v ，_w 被_p 认为_v 在_p 生物_n 体内_s 可以_v 长效_d 行使_v 转录_vn 调控_vn 功能_n 。_w</s><s>同_v 一_m 段_q 基因_n 组_n 序列_n 可能_v 会_v 产生_v 多_a 种_q 类型_n 的_u circRNA_nx 分子_n ，_w 外显_n 子_n 和_c 内含_n 子_n 的_u 不同_a 剪切_vn 组合_n 使得_v circRNA_nx 可能_v 包含_v 多_a 个_q 外显_n 子_n 或_c 内含_n 子_n 序列_n [_w 8_m ]_w 。_w</s><s>circRNA_nx 具有_v 吸附_v miRNA_nx 分子_n 的_u “_w 海绵_n ”_w 作用_n ，_w 介入_v miRNA_nx 对_p m_nx RNA_nx 的_u 调控_vn 过程_n 。_w</s><s>circRNA_nx 对_p 相同_a 基因_n 组_n 位置_n 上_f 的_u mRNA_nx 转录_n 有_v 竞争性_n 抑制_vn 作用_n [_w 9_m ]_w ，_w 含有_v 外显_n 子_Ng 的_u circRNA_nx 还_d 可能_v 开_v 环_n 并_c 重新_d 翻译_v [_w 10_m ]_w 。_w</s><s>由于_c circRNA_nx 在_p 生物_n 体内_s 稳定_a 地_u 行使_v 功能_n ，_w 并_c 具有_v 组织_v 特异_a 性_n 表达_vn 模式_n ，_w 与_p 宿主_n 基因_n 表达_vn 不_d 太_d 相关_v ，_w 被_p 认为_v 在_p 作为_p 相关_vn 疾病_n 的_u 临床_vn 诊断_vn 、_w 预防_vn 的_u 分子_n 标志_n 物_n 以及_c 药物_n 治疗_vn 靶_n 点_n 等_u 方面_n 具有_v 极_d 大_a 的_u 潜力_n [_w 11_m ]_w 。_w</s>
<s>2._m 5_m 全_a 转录_n 测_v 序_n</s>
<s>mRNA_nx 的_u 转录_vn 水平_n 受_v lncRNA_nx 、_w small_nx RNA_nx 和_c circRNA_nx 的_u 调控_vn 作用_n 影响_v ，_w 定量_vd 分析_v 某个_r 时空_n 的_u 细胞_n 或_c 特定_b 组织_n 中_f 的_u 生物_n 分子_n 网络_n 和_c 调控_vn 途径_n 时_Ng ，_w 需要_v 对_p 整个_b 转录_vn 组_n 中_f 全部_m 的_u RNA_nx 分子_n 进行_v 定量_vn 和_c 定性_vn 的_u 研究_vn 。_w</s><s>全_a 转录_n 组_n 测_v 序_n （_w Whole_nx transcriptome_nx sequencing_nx ）_w 能够_v 测定_v 样本_n 中_f 的_u 全部_m 完整_a 的_u 转录_n 本_n ，_w 主要_d 包括_v mRNA_nx 和_c 非_h 编码_n RNA_nx (_w lncRNA_nx ,_w circRNA_nx 和_c miRNA_nx ）_w 。_w</s><s>全_a 转录_vn 本_n 测_v 序_n 与_p 常规_n RNA_nx -_w seq_nx 的_u 区别_n 主要_d 是_v 建_v 库_n 方式_n 的_u 不同_a 。_w</s><s>全_a 转录_vn 组_n 测_v 序_n 在_p 建_v 库_n 过程_n 中_f 需_v 分别_d 建立_v 2_m 个_q 文库_n （_w mRNA_nx +_w lncRNA_nx +_w circRNA_nx 文库_n 和_c miRNA_nx 文库_n ）_w 或_c 3_m 个_q 文库_n （_w mRNA_nx +_w lncRNA_nx 文库_n 、_w circRNA_nx 文库_n 和_c miRNA_nx 文库_n ）_w 。_w</s><s>通过_p 全_a 转录_n 组_n 数据_n ，_w 不仅_c 可以_v 获得_v 全部_m 类型_n 转录_n 本_n 的_u 表达_vn 图谱_n ，_w 在_p 此_r 基础_n 之上_f ，_w 对_p 不同_a RNA_nx 分子_n 进行_v 鉴定_vn 和_c 注释_vn ，_w 分析_v 其_r 编码_vn 蛋白_n 和_c 调控_vn 功能_n ，_w 并_c 对_p RNA_nx 分子_n 之间_f 的_u 互_d 作_vn 调控_vn 网络_n 进行_v 分析_vn ，_w 从_p 整体_n 上_f 全面_a 系统_a 的_u 分析_v 特定_b 细胞_n 在_p 特定_b 时空_n 下_f 的_u 生物学_n 特征_n 。_w</s>
<s>2.6_m 单细胞_n 转录_vn 组_n 测_v 序_n</s>
<s>Eberwine_nx 等_u [_w 12_m ]_w 和_c Brady_nx 等_u [_w 13_m ]_w 分别_d 开发_v 了_u 通过_p 体外_s 转录_vn 线性_n 扩_vn 增_vn 和_c PCR_nx 指数_n 扩_vn 增_vn 单个_b 细胞_n 的_u 互补_vn DNA_nx (_w cDNAs_nx ）_w 技术_n ，_w 这_r 类_q 技术_n 与_p 高_a 通_n 量_n 测_v 序_n 技术_n 结合_v ，_w 衍生_v 出_v 了_u 单个_b 细胞_n 内_f 转录_vn 本_n 测_v 序_n 技术_n （_w single_nx cell_nx RNA_nx -_w seq_nx ,_w scRNA_nx -_w seq_nx ）_w 。_w</s><s>单细胞_n 转录_n 组_n 测_v 序_n 技术_n 是_v 在_p 单细胞_n 水平_n 研究_v 整个_b 转录_n 组_n 的_u 技术_n ，_w 用于_v 评估_v 单个_b 细胞_n 间_f 基因_n 表达_vn 的_u 差异_n ，_w 能_v 避免_v 细胞_n 类型_n 混杂_v 而_c 引入_v 的_u 假_a 阴性_n 结果_n ，_w 有_v 可能_n 识别_v 出_v 无法_v 通过_p 混合_vn 细胞_n 检测_v 到_v 的_u 罕见_a 的_u 细胞_n 群体_n 。_w</s><s>目前_t 常见_a 的_u 单细胞_b 测_v 序_n 平台_n 包括_v Fluidigm_nx 、_w WaferGen_nx 、_w 10×Genomics_nx 、_w 和_c Illumina_nx /_w Bio_nx -_w Rad_nx 等_u 测_v 序_n 平台_n 。_w</s><s>与_p 其他_r RNA_nx 测_v 序_n 技术_n 不同_a ，_w scRNA_nx -_w seq_nx 需要_v 首先_d 分离_v 并_c 获得_v 单个_b 细胞_n 内_f 的_u 全部_m 转录_n 组_n 。_w</s><s>单细胞_n 分离_vn 是_v scRNA_nx -_w seq_nx 的_u 关键_a 步骤_n ，_w 主要_d 通过_p 连续_ad 稀释_v 、_w 显微_d 操作_v 分离_v 、_w 荧光_n 激活_v 细胞_n 分_vn 选_vn （_w Fluorescence_nx -_w activated_nx cell_nx sorting_nx ,_w FACS_nx ）_w 和_c 微_b 流_vn 控_vn 分离_vn （_w Microfluidic_nx technology_nx ）_w 等_u 技术_n 实现_v 。_w</s><s>2009_m 年_q ，_w Tang_n 等_u [_w 14_m ]_w 首次_n 报道_v 利用_v scRNA_nx -_w seq_nx 技术_n 来_v 鉴定_v 早期_f 发育_vn 阶段_n 的_u 不同_a 类别_n 细胞_n 。_w</s>
<s>3_m 转录组_n 测_v 序_n 文库_n 的_u 构建_vn</s>
<s>进行_v 转录_vn 组_n 测_v 序_n 时_Ng ，_w 提取_v 样本_n 中_f 总_b RNA_nx 后_f ，_w 去除_v rRNA_nx ，_w 对_p 目标_n RNA_nx 分子_n 富_v 集_v 后_f 进行_v 测_v 序_n 文库_n 的_u 构建_vn 。_w</s><s>测_v 序_vn 文库_n ，_w 分为_v 非_h 链_Ng 特异_a 性_n 文库_n （_w Non-strandspecific_nx library_nx ）_w 和_c 链_Ng 特异_a 性_n 文库_n （_w Strand-specific_nx library_nx ）_w 两_m 种_q 。_w</s><s>非_h 链_Ng 特异性_n 文库_n 是_v 指_v ，_w RNA_nx 逆转_vd 录成_v 双_m 链_Ng cDNA_nx ，_w 随机_d 加上_v 接头_n 、_w 不_d 区分_v RNA_nx 的_u 链_Ng 的_u 信息_n 的_u 文库_n 。_w</s><s>测_v 序_n 时_Ng 以_p 双_m 链_Ng cDNA_nx 进行_v 测_v 序_n ，_w 无法_v 区分_v m_nx RNA_nx 的_u 转录_n 方向_n （_w 图_n 2_m -_w A_nx ）_w 。_w</s><s>链_Ng 特异_a 性_n 文库_n 可以_v 分为_v 2_m 类_q ，_w 一_m 种_q 以_p 化学_n 修饰_v 标记_n 一_m 条_q 链_Ng ，_w 比如_v 通过_p 重_a 硫酸盐_n 处理_v RNA_nx 分子_n （_w 图_n 2_m -_w B_nx ）_w ，_w 或者_c 在_p 第二_m 链_Ng cDNA_nx 合成_v 时_Ng 引入_v dUTP_nx （_w 图_n 2_m -_w C_nx ）_w ，_w 然后_c 降解_v 含有_v U_nx 的_u 链_Ng ；_w 另_r 一_m 种_q 是_v 以_p 不同_a 接头_n 连接_v RNA_nx 分子_n 或_c 合成_v cDNA_nx 链_Ng 的_u 5_m '_w 和_c 3_m '_w 末端_n ，_w 来_v 区分_v 正_b 反义_b 链_Ng （_w 图_n 2D_nx -_w H_nx ）_w 。_w</s><s>Levin_nx 等_u [_w 15_m ]_w 对_p 不同_a 类型_n 的_u 链_Ng 特性_n 文库_n 的_u 复杂性_n 、_w 均匀_a 性_n 和_c 覆盖_vn 连续性_n 进行_v 评价_vn ，_w 并_c 与_p 已知_vn 基因_n 组_n 注释_vn 和_c 表达_vn 谱_Ng 的_u 基因_n 定量_vn 进行_v 比较_vn ，_w 再_d 结合_v 实验_n 操作_vn 和_c 计算_vn 的_u 简便_a 性_n ，_w 认为_v dUTP_nx 第二_m 链_Ng 标记_n 的_u 方法_n 和_c Illumina_nx RNA_nx ligation_nx 方法_n 效果_n 较_d 好_a 。_w</s>
<s>在_p 转录_n 组_n 测_v 序_n 时_Ng ，_w 区分_v RNA_nx 分子_n 链_Ng 的_u 来源_n 能够_v 避免_v 基因_n 反义_n 链上_s 的_u reads_nx 的_u 干扰_vn ，_w 能够_v 提高_v 基因_n 转录_vn 本_n 鉴定_vn 和_c 转录_vn 本_n 定量_vn 的_u 精确性_n 。_w</s><s>利用_v 转录_n 组_n 数据_n 进行_v 从_p 头_n 拼接_v 时_Ng ，_w 有助于_v 划分_v 转录_n 本_n 的_u 边界_n ，_w 确定_v 转录_n 本_n 的_u 正义_n 链_Ng 信息_n 。_w</s>
<s>4_m 转录组_n 数据_n 处理_vn 流程_n</s>
<s>转录_n 本_n 测_v 序_n 数据_n 用于_v 比较_v 不同_a 组别_n 之间_f 基因_n 水平_n 或_c 转录_n 本_n 水平_n 的_u 定量_n 差异_n 时_Ng ，_w 其_r 分析_vn 基本_a 流程_n 包括_v 原始_a 数据_n 预_d 处理_v 、_w reads_nx 比对_v 、_w 转录_n 本_n 组装_vn 、_w 新_a 转录_n 本_n 预测_vn 、_w 转录_n 本_n 表达_vn 水平_n 分析_vn 等_u 步骤_n 。_w</s><s>后续_v 根据_p 实验_v 的_u 目的_n ，_w 可_v 进一步_d 分析_v 实验_vn 组_n 与_p 对照_vn 组_n 之间_f 的_u 转录_vn 本_n 表达_vn 差异_n 情况_n ，_w 样本_n 之间_f 基因_n 表达_vn 模式_n 聚_v 类_vn ，_w 以及_c 和_p 其它_r 组_n 学_n 数据_n 进行_v 联合_vn 分析_vn 等_u 。_w</s><s>其中_r ，_w 转录本_n 组装_vn 是_v 根据_p read_nx 比对_v 的_u 结果_n 来_v 识别_v 样本_n 中_f 所有_b 表达_vn 的_u 转录本_n 。_w</s><s>如果_c 没有_v 可_v 用_v 的_u 参考_vn 基因_n 组_n 序列_n ，_w 则_c 可以_v 直接_ad 使用_v 从_p 头_n 组装_vn 方法_n 执行_v 此_r 过程_n 。_w</s><s>一旦_c 确定_v 了_u 所有_b 转录_vn 本_n ，_w 就_d 可以_v 根据_p 比对_v 至_p 转录_vn 本_n 序列_n 上_f 的_u reads_nx 数目_n 估计_v 基因_n 的_u 表达_vn 丰_Ag 度_n ，_w 进而_c 在_p 分组_vn 样本_n 之间_f 计算_v 差异_n 表达_v 转录_n 本_n 并_c 分析_v 转录_vn 本_n 表达_vn 情况_n 与_p 分组_vn 设计_v 之间_f 的_u 生物学_n 关联_vn 。_w</s>
<s>4.1_m 原始_a 数据_n 预_d 处理_vn</s>
<s>获得_v 的_u 二_m 代_q 测_v 序_n 原始_a 数据_n 后_f ，_w 需要_v 对_p 数据_n 质量_n 进行_v 评估_vn 并_c 进行_v 质量_n 控制_vn （_w Quality_nx control_nx ,_w QC_nx ）_w ，_w 评估_vn 内容_n 包括_v 数据_n 产出_vn 量_n 、_w GC_nx 含量_n 、_w rRNA_nx 含量_n 、_w 碱基_n 质量_n 分布_vn 和_c 重复_vn 序列_n 等_u 。_w</s><s>将_p 其中_r 低质量_n 的_u reads_nx 和_c 接头_n 序列_n 等_u 去除_v ，_w 得到_v 质控_j 后_f 的_u clean_nx data_nx 用_v 于_p 后续_vn 分析_vn 。_w</s><s>常用_a 的_u 质控_j 软件_n 有_v Trimmomatic_nx [_w 16_m ]_w 、_w RSeQC_nx [_w 17_m ]_w 、_w FASTX_nx (_w http_nx ：_w /_w /hannonlab.cshl.edu/fastx＿toolkit_nx /_w ）_w 、_w Trim_nx Galore_nx (_w https_nx ：_w /_w /www.bioinformatics.babraham.ac.uk_nx /_w projects_nx /_w trim_nx ＿_w galore_nx /_w ）_w 等_u 。_w</s><s>以_p 常用_a 的_u Trimmomatic_nx 软件_n 为_v 例_n ，_w 对于_p 双_m 段_q 测_v 序_n 的_u Illumina_nx 格式_n 的_u rawdata_nx ，_w 其_r 默认_vn 处理_vn 参数_n 为_v “_w ILLUMINACLIP_nx :_w TruSeq3_nx -_w PE_nx ._w fa_nx :_w 2_m :_w 30_m :_w 10_m LEADING_nx :_w 3_m TRAILING_n :_w 3_m SLIDINGWINDOW_nx :_w 4_m :_w 15_m MINLEN_nx :_w 36_m ”_w ,_w ILLUMINACLIP_nx :_w TruSeq3_nx -_w PE_nx ._m fa_nx :_w 2_m :_w 30_m :_w 10_m 含义_n 是_v 根据_p TruSeq3_nx -_w PE_nx ._w fa_nx 文件_n 中_f 的_u 测_v 序_Ng 接头_n 序列_n 信息_n 过滤_vn 原始_a 数据_n 中_f 的_u 测_v 序_Ng 接头_n 和_c 引_v 物_Ng 序列_n ，_w 允许_v 最_d 大_a 错_vn 配_v 碱_n 基数_n 为_v 2_m ,_w plindrome_nx clip_nx 阈_n 值_n 为_v 30_m ,_w simple_nx clip_nx 阈_n 值_n 为_v 10_m ，_w 根据_p 这_r 三_m 个_q 值_n 的_u 设定_vn 来_v 判断_v 接头_n 序列_n 与_p read_nx 的_u 比对_vn 程度_n ；_w LEADING_nx :_w 3_m ，_w 从_p 序列_n 开头_n 去除_v 碱基_n 质量_n 低于_v 3_m 的_u 碱_n 基_n ；_w TRAILING_nx :_w 3_m ，_w 从_p 序列_n 结尾_n 去除_v 碱_n 基_n 质量_n 低于_v 3_m 的_u 碱_n 基_n ；_w SLIDINGWINDOW_nx :_w 4_m :_w 15_m ，_w 设置_v 4_m bp_q 窗口_s ，_w 碱_n 基_Ng 平均_a 质量_n 值_n 阈_n 值_n 为_v 15_m ;_w MINLEN_nx :_w 36_m ，_w 若_c 质控_v 后_f read_nx 长度_n 小于_v 36_m bp_q 则_c 丢弃_v 此_r 条_q read_nx 。_w</s><s>QC_nx 后_f 得到_v 的_u 数据_n 称为_v clean_nx data_nx ，_w 用于_v 后续_v 的_u 数据_n 分析_vn 。_w</s>
<s>图_n 2_m 几_m 种_q 类型_n 文库_n 的_u 构建_vn 流程_n 示意图_n</s>
<s>A_nx :_w 非_h 链_Ng 特异_n 性_n 文库_n ;_w B_nx -_w C_nx :_w 标记_n 链_Ng 的_u 链_Ng 特异_n 性_n 文库_n ;_w D_nx -_w H_nx :_w 基于_p 不同_a 接头_n 的_u 链_Ng 特异_n 性_n 文库_n 。_w</s><s>B_nx :_w 重_a 硫酸盐_n 处理_vn ,_w C_nx :_w dUTP_nx 第二_m 链_n 合成_vn 文库_n ;_w D_nx :_w RNA_n ligation_nx (_w with_v cleanup_nx )_w 文库_n ;_w E_nx :_w Illumina_nx RNA_n ligation_nx (_w without_nx cleanup_nx )_w 文库_n ;_w F_nx :_w SMART_nx (_w Switching_nx mechanism_nx at_v 5_m '_w end_a of_w RNA_nx template_nx )_w 文库_n ;_w G_nx :_w SMART_nx -_w RNA_n ligation_nx 文库_n ;_w H_nx :_w NNSR_nx (_w Not_d not_a so_nx random_nx priming_nx )_w 文库_n 。_w</s><s>灰色_n 代表_v mRNA_nx ,_w 红色_n 为_v 3_m '_w 接头_n ,_w 蓝色_n 为_v 5_m '_w 接头_n 。_w</s><s>B-_nx H_nx 整理_v 自_p 文献_n [_w 15_m ]_w</s>
<s>4.2_m reads_n 比_vn 对_vn</s>
<s>转录组_n 数据_n 主要_d 来自_v 基因组_n 的_u 外显_vn 子序列_n ，_w 将_p 测序_v 获得_v 的_u 转录组_n reads_nx 比对_v 至_v 基因组_n 序列_n 上_f ，_w 会_v 被_p 内含_v 子序列_n 隔断_v 。_w</s><s>应用_v 于_p 转录_n 组_n 数据_n 的_u 比对_vn 软件_n ，_w 常用_a 的_u 有_v bowtie_nx [_w 18_m ]_w ，_w bowtie2_nx [_w 19_m ]_w ，_w STAR_nx [_w 20_m ]_w ，_w HISAT_nx /_w HISAT2_nx [_w 21_m ]_w 等_u 。_w</s><s>这_r 类_q 软件_n 适用_v 于_p 转录组_n reads_nx 的_u 分割_vn 并_c 比对_v 至_p 参考_vn 基因组_n 序列_n 。_w</s><s>BWA_nx [_w 22_m ]_w 软件_n 的_u 比对_vn 算法_n 被_p 认为_v 对于_p 分割_v 比对_n 不_d 敏感_a ，_w 因而_c 不_d 适合_v 用于_v RNA_nx 序列_n 与_p 含有_v 内含_n 子_n 序列_n 的_u 基因_n 组_n 序列_n 之间_f 的_u 比对_vn 。_w</s>
<s>4.3_m 转录本_n 组装_vn</s>
<s>转录本_n 组装_vn 就_d 是_v 将_p 测_v 序_Ng 数据_n 组装_v 成_v 转录本_n 。_w</s><s>对于_p 有_v 参考_vn 基因_n 组_n 的_u 物种_n ，_w 根据_p 转录_vn 组_n 比对_v 后_f 的_u 结果_n ，_w 明确_v 外显_n 子_Ng 之间_f 的_u 连接_vn 方式_n ，_w 从而_c 构建_v 出_v 转录_vn 本_n 的_u 结构_n 。_w</s><s>常用_a 工具_n 包括_v Cufflinks_nx [_w 23_m ]_w 和_c Scripture_nx [_w 24_m ]_w 。_w</s><s>对于_p 无_v 参考_vn 基因_n 组_n 序列_n 的_u 转录_vn 组_n 数据_n ，_w 为了_p 获得_v 完整_a 的_u 转录_vn 本_n 序列_n ，_w 需要_v 对_p RNA_nx 测_v 序_n 得到_v 的_u 短_a reads_nx 进行_v 从_p 头_n 组装_v 。_w</s><s>对于_p 无_v 参_Ng 物种_n 进行_v 转录_vn 组_n 研究_vn ，_w 往往_d 需要_v 较_d 多_a 的_u 测_v 序_n 数据_n 量_n 来_v 满足_v 进行_v 从_p 头_n 组装_v 的_u 要求_n 。_w</s><s>用于_v 组装_v 的_u 有效_a 数据量_n 越_d 大_a ，_w 拼接_v 得到_v 的_u 转录_n 本_n 数量_n 和_c 完整性_n 越_d 好_a ，_w 也_d 更_d 容易_ad 检测_v 到_v 表达_vn 量_n 较_d 低_a 的_u 转录_n 本_n 。_w</s><s>常_d 用_a 工具_n 包括_v Trinity_nx [_w 25_m ]_w 、_w TransAbySS_nx [_w 26_m ]_w 和_c Velvet_nx [_w 27_m ]_w 等_u 。_w</s><s>以_p Trinity_nx 组装_v 小鼠_n 的_u 转录组_n 数据_n 时_Ng ，_w 为了_p 保证_v 组装_vn 效果_n ，_w 至少_d 需要_v 30×_m 以上_f 覆盖度_n 的_u 测_v 序_Ng reads_nx [_w 28_m ]_w 。_w</s>
<s>4.4_m 转录本_n 预测_vn</s>
<s>大多数_m 基因_n 有_v 多_a 种_q 剪接_vn 形式_n ，_w 且_c 有_v 可能_n 产生_v 多_a 种_q 转录_vn 本_n ，_w 从而_c 编码_v 产生_v 不同_a 的_u 蛋白_n ，_w 这样_r 有_v 可能_n 造成_v 一_m 个_q 基因_n 有_v 多_a 种_q 功能_n 。_w</s><s>对_p 转录_n 本_n 测_v 序_n 数据_n 进行_v 拼接_vn 和_c 组装_vn 后_f ，_w 不仅_c 会_v 得到_v 已知_v 的_u 转录_n 本_n 信息_n ，_w 也_d 会_v 得到_v 新_a 的_u 转录_n 本_n 序列_n ，_w 需要_v 对_p 新_a 的_u 转录_n 本_n 进行_v 鉴定_vn 和_c 注释_vn ，_w 特别_d 是_v 之前_f 研究_v 较_d 少_a 的_u 新_a 的_u ncRNA_nx 转录_vn 本_n 。_w</s>
<s>对于_p 有_v 参考_vn 基因_n 组_n 和_c 转录_vn 本_n 参考_vn 信息_n 的_u 物种_n ，_w 转录_vn 本_n 结构_n 主要_d 是_v 根据_p 测_v 序_n 得到_v reads_nx 进行_v 比对_vn ，_w reads_nx 覆盖_v 了_u 全部_m 的_u 转录_vn 本_n 序列_n ，_w 依靠_v 基因_n 组_n 序列_n 组装_v 出_v 完整_a 的_u 转录_vn 本_n 信息_n 。_w</s><s>对于_p 无_v 参考_v 基因_n 组_n 的_u 物种_n ，_w 需要_v 自行_d 组装_v 出_v 基因_n 的_u 转录_vn 本_n 序列_n 。_w</s><s>得到_v 的_u 基因_n 或_c 转录_n 本_n 序列_n 可以_v 与_p 同_v 物种_n 或_c 近_a 源_Ng 物种_n 的_u unigene_nx 和_c EST_nx 数据库_n 进行_v 比较_vn ，_w 以_c 判断_v 得到_v 的_u 基因_n 或_c 转录_n 本_n 序列_n 的_u 可靠性_n 。_w</s><s>这_r 一_m 过程_n 中_f 常用_a blast_nx 方法_n 进行_v 比对_vn ，_w 快速_d 鉴定_vn 序列_n 之间_f 的_u 相似_a 度_n 。_w</s><s>在_p 新_a 的_u lncRNA_nx 的_u 鉴定_vn 分析_vn 中_f ，_w 一般_ad 是_v 根据_p lncRNA_nx 分子_n 特性_n ，_w 在_p 转录_n 组_n 数据_n 中_f 提取_v 外显_vn 子_n 总长_n >_w 200_m nt_nx 的_u 转录_n 本_n ，_w 然后_c 根据_p 开放_a 阅读_vn 框_Ng 预测_v 和_c 与_p 已知_v 的_u 蛋白_n 数据库_n 进行_v 比较_vn ，_w 从而_c 进一步_d 将_p lncRNA_nx 从_p mRNA_nx 中_f 分离_v 出来_v 。_w</s>
<s>4_m ._w 5_m 转录_n 本_n 表达_vn 水平_n 分析_vn</s>
<s>将_p reads_nx 比对到_v 相应_v 的_u 基因_n 组_n 位置_n 或_c 从_p 头组_n 装出_v 转录本_n 后_f ，_w 得到_v 每_r 个_q 基因_n 或_c 转录本_n 上_f 的_u reads_nx 数_n 在_p 一定_b 程度_n 上_f 可以_v 反映_v 其_r 表达_vn 丰度_n 。_w</s><s>由于_c 样本_n 间_f 的_u 数据_n 总_b 产出_vn 量_n 、_w 样本_n 间_f 基因_n 表达_vn 数目_n 、_w 样本_n 内_f 不同_a 基因_n 长度_n 甚至_d 是_v 同_v 一_m 个_q 基因_n 内部_f 不同_a 转录_n 本_n 分布_vn 都_d 可能_v 存在_v 明显_a 差异_n ，_w 在_p 不同_a 样本_n 之间_f 对于_p 同_v 一_m 个_q 基因_n 或_c 转录_n 本_n 的_u 表达_vn 量_n 进行_v 比较_vn 时_Ng ，_w 则_d 需要_v 对于_p 样本_n 间_f 的_u 数据_n 进行_v 归_v 一_vn 化_vn 处理_vn [_w 29_m ]_w 。_w</s><s>处理_v 后_f 的_u 转录_n 本_n 表达量_n 一般_ad 以_p RPKM_q (_w Reads_nx per_nx kilobase_nx per_nx million_nx mapped_nx reads_nx ）_w 、_w FPKM_nx (_w Fragments_nx per_nx kilobase_nx per_nx million_nr mapped_nx reads_nx ）_w 或_c TPM_nx (_w Transcripts_nx per_nx million_nx ）_w 这_r 3_m 类_q 数值_n 表示_v 。_w</s><s>RPKM_nx 针对_p 早期_t 的_u SE_nx 测_v 序_n ，_w FPKM_nx 则_c 是_v 在_p PE_nx 测_v 序_n 上_f 对_p RPKM_nx 的_u 校正_vn ，_w 且_c 应用_v 于_p 双_m 段_q 测_v 序_n 的_u RNA_nx -_w seq_nx 分析_vn 中_f 。_w</s><s>对于_p 单_b 端_Ng 测_v 序_Ng 结果_n ，_w 基因_n 的_u RPKM_q 与_p FPKM_nx 值_n 相等_v 。_w</s><s>TPM_n 以_p 转录_vn 本_n 条_q 数_n 代表_v 每_r 个_q 转录_n 本_n 的_u 表达量_n ，_w 当_p 样本_n 之间_f 表达_v 的_u 基因_n 综述_vn 差异_n 很_d 大_a 的_u 时候_n ，_w TPM_n 值_n 比_p FPKM_nx 值_n 更_d 能_v 代表_v 转录本_n 的_u 表达量_n 。_w</s><s>Cufflinks_nx [_w 30_m ]_w 、_w DESeq_nx /_w DESeq2_nx [_w 31-32_m ]_w 、_w EDGR_nx [_w 33_m ]_w 等_u 软件_n 可_v 用来_v 进行_v 表达量_n 的_u 确定_vn 。_w</s><s>另外_c 在_p 进行_v 不同_a 样本_n 之间_f 的_u 基因_n 表达_vn 量_n 比较_vn 分析_vn 时_Ng ，_w 依据_p 实验_v 设计_v 利用_v 统计学_n 方法_n 检验_v 实验_vn 组_n 与_c 对照_vn 组_n 之间_f 的_u 差异_n 基因_n 。_w</s><s>由于_c 同时_d 对_p 成千上万_i 的_u 基因_n 进行_v 统计_vn 检验_vn ，_w 因而_c 需要_v 考虑_v 多_a 重_q 检验_vn 引入_v 的_u 假_a 阳性_n 升高_vn ，_w 因而_c 常用_a FDR_nx 等_u 多_a 重_q 检验_vn 校正_v 的_u 方法_n 对_p 比较_v 分析_v 的_u 显著_a 性_n 进行_v 校正_vn 。_w</s>
<s>scRNA_nx -_w seq_nx 中_f 基因_n 表达_n 量_n 确定_vn 与_p 常规_n RNA_nx -_w seq_nx 数据_n 处理_vn 思路_n 一致_a ，_w 但_c 由于_c scRNA_nx -_w seq_nx 的_u 产出_vn 数据_n 中_f 一般_a 噪音_n 较_d 大_a ，_w 并且_c 有_v 大量_m 的_u 空_a 值_n （_w Dropouts_nx ）_w ，_w 在_p 基因_n 表达_n 矩阵_n 中_f 超过_v 50%_m 的_u 基因_n 为_v 空_n 值_n 也_d 很_d 常见_a ，_w 因而_c 需要_v 使用_v 填充_vn 算法_n 进行_v 数据_n 的_u 修正_vn [_w 34_m -_w 35_m ]_w 。_w</s><s>对于_p scRNA_nx -_w seq_nx 空_a 值_n 的_u 解释_vn ，_w 除_p 部分_m 基因_n 本身_r 在_p 该_r 单个_b 细胞_n 中_f 不_d 表达_v ，_w 还_d 可能_v 是_v 因为_p 一些_m 基因_n 表达_n 量_n 较_d 低_a 或者是_c 测_v 序_n 深度_n 不_d 够_v ，_w 导致_v 在_p 实验_v 中_f 未_d 被_p 检出_v [_w 34_m ]_w 。_w</s><s>在_p 数据_n 分析_vn 中_f ，_w 需要_v 谨慎_ad 对待_v 空_n 值_n ，_w 根据_p 细胞_n -_w 细胞_n 、_w 基因_n -_w 基因_n 之间_f 关系_n 对_p 空_n 值_n 进行_v 推断_vn 。_w</s><s>推断_v scRNA_nx -_w seq_nx 中_f 的_u 技术_n 噪声_n 比较_d 困难_a ，_w 单个_b 细胞_n 之间_f 的_u 测_v 序_n 结果_n 属于_v 生物学_n 重复_vn 而_c 不_d 能_v 用于_v 推断_v 技术_n 重复_vn 偏差_n 。_w</s>
<s>4.6_m 变异_n 检测_vn</s>
<s>分析_v 转录_n 组_n 测_v 序_n 数据_n ，_w 可以_v 获得_v 样本_n 的_u 全部_m 转录本_n 的_u 序列_n 信息_n ，_w 包括_v 转录本_n 上_f 全部_m 的_u SNP_nx 和_c Indel_nx 等_u 突变_vn 类型_n 。_w</s><s>转录_v 生成_v 的_u RNA_nx 分子_n 在_p 翻译_v 之前_f 可能_v 会_v 经历_v 多_a 种_q 修饰_vn [_w 36_m ]_w ，_w 如_v A_nx -_w to_nx -_w I_nx 的_u RNA_nx 编辑_vn 过程_n ，_w 从而_c 进一步_d 增加_v 转录_vn 组_n 的_u 复杂性_n 。_w</s><s>分析_v 转录_n 本_n 中_f 的_u 突变_vn 信息_n ，_w 可以_v 捕获_v 基因_n 从_p DNA_nx 向_p RNA_nx 转录_n 中_f 修饰_v 过程_n ，_w 从而_c 探究_v 转录_vn 过程_n 中_f 复杂_a 的_u 调控_vn 机制_n 。_w</s><s>SAMtools_nx [_w 37_m ]_w 、_w BCFtools_nx [_w 38_m ]_w 和_c GATK_nx [_w 39_m ]_w 等_u 软件_n 可_v 用来_v 检测_v 转录组_n 中_f 相关_v 的_u 变异_n 。_w</s>
<s>5_m RNA_nx -_w seq_nx 的_u 应用_vn</s>
<s>5.1_m 确定_v 基因_n 的_u 表达_vn 模式_n</s>
<s>RNA_nx -_w seq_nx 技术_n 使得_v 研究_v 整个_b 转录_vn 组_n 中_f 基因_n 表达_vn 情况_n 更为_d 快速_b 和_c 容易_a ，_w 对于_p 有_v 参考_v 基因_n 组_n 的_u 物种_n 或_c 无_v 参考_v 基因_n 组_n 的_u 物种_n ，_w 采取_v 不同_a 的_u 分析_vn 策略_n ，_w 即_v 可_v 高效_b 地_u 获得_v 某_r 一_m 特定_b 状态_n 下_f 细胞_n 或_c 组织_n 中_f 的_u 全部_m 转录_n 本_n 信息_n ，_w 进而_c 研究_v 不同_a 组织_n 器官_n 或_c 发育_vn 阶段_n 之间_f 的_u 基因_n 表达_vn 模式_n 差异_n 。_w</s><s>另外_c ，_w 随着_p 转录_n 组_n 测_v 序_Ng 数据_n 的_u 积累_vn ，_w 从而_c 建立_v 起_v 各_r 类_q 转录_n 组_n 数据库_n ，_w 这些_r 信息_n 的_u 积累_vn 为_p 后续_v 进一步_d 研究_v 特定_b 生理_n 条件_n 下_f 的_u 转录_n 本_n 种类_n 和_c 表达_vn 量_n 、_w 转录_n 本_n 之间_f 互_d 作_v 以及_c 转录_vn 调控_vn 研究_vn 等_u 提供_v 参考_vn 。_w</s><s>例如_v ，_w 基于_p RNA_nx -_w seq_nx 数据_n 建立_v 起来_v 的_u 拟_v 南_f 芥_n 的_u 基因_n 表达_vn 谱_Ng 数据库_n TraVA_nx (_w http_nx ：_w /_w /_w travadb_nx ._m org_nx /_w ）_w ，_w 包含_v 了_u 79_m 个_q 样本_n 的_u 25_m 706_m 个_q 蛋白质_n 编码_n 基因_n ，_w 可以_v 提供_v 不同_a 器官_n 和_c 发育_vn 阶段_n 之间_f 的_u 基因_n 表达_vn 谱_Ng 和_c 差异_n 表达_vn 基因_n 的_u 研究_vn [_w 40_m ]_w 。_w</s><s>基于_p miRNA-_nx seq_nx 建立_v 的_u miRBase_nx 数据库_n 收录_v 了_u 200_m 多_m 个_q 物种_n 的_u 数_m 万_m 条_q miRNA_nx 信息_n ，_w 可_v 用于_v 进行_v miRNA_nx 注释_vn 和_c 比较_vn [_w 41_m ]_w 。_w</s>
<s>5.2_m 用于_v 发现_v 新_a 转录本_n</s>
<s>基于_p NGS_nx 技术_n 的_u 转录_vn 组_n 测_v 序_n ，_w 通过_p 拼接_vn 算法_n 可以_v 获得_v 完整_a 的_u 转录_n 本_n 序列_n ，_w 但_c 对于_p 存在_v 多_a 个_q 可变_vn 剪接_vn 形式_n 的_u 基因_n ，_w 不同_a 转录_n 本_n 之间_f 的_u 识别_vn 仍然_d 存在_v 困难_an 。_w</s><s>单_b 分子_n 测_v 序_n 技术_n 应用_v 于_p 转录_n 组_n 测_v 序_n ，_w 可以_v 用_p 测_v 序_n 读_v 长_a 较_d 长_a 的_u 优势_n 直接_ad 获得_v 完整_a 的_u 转录_n 本_n 序列_n ，_w 不_d 再_d 需要_v 对于_p NGS_nx 短_a 的_u reads_nx 进行_v 组装_vn ，_w 可以_v 准确_ad 获得_v 不同_a 可变_v 剪接_v 的_u 转录_n 本_n 序列_n 和_c 表达_vn 量_n [_w 42_m ]_w 。_w</s><s>Wang_nx 等_u [_w 43_m ]_w 利用_v Pacbio_n Isoform_nz Sequence_nx (_w Iso_nx -_w seq_nx ）_w 平台_n 分析_v 鉴定_v 玉米_n 和_c 高粱_n 的_u 异_Ag 构_n 体_n ，_w 发现_v 超过_v 40%_m 的_u 转录_n 本_n 具有_v 新颖_a 和_c 多种多样_l 的_u 剪接_vn 方式_n 。_w</s>
<s>5.3_m 非_h 编码_n RNA_nx 的_u 调控_vn 机制_n</s>
<s>非_h 编码_n RNA_nx 不_d 能_v 形成_v 蛋白_n 产物_n ，_w 但_c 其_r 在_p 生物学_n 过程_n 中_f 发挥_v 着_u 不_d 可_v 忽略_v 的_u 重要_a 的_u 调控_vn 功能_n 。_w</s><s>近年_l 来_f ，_w 通过_p NGS_nx 技术_n 和_c RNA_nx -_w seq_nx 在_p 各_r 种_q 细胞_n 和_c 组织_n 中_f 发现_v 了_u 大量_m 的_u ncRNA_nx ，_w 它们_r 的_u 类型_n 和_c 表达_vn 量_n ，_w 往往_d 反映_v 了_u 物种_n 特征_n 以及_c 特定_b 生理_n 状态_n 。_w</s><s>特别_d 在_p 动植物_j 育种_vn 、_w 抗病_vn 和_c 环境_n 适应性_n 的_u 研究_vn 中_f ，_w ncRNA_nx 的_u 作用_n 越来越_d 受到_v 重视_vn 。_w</s><s>在_p 拟南芥_n 中_f ，_w 病原菌_n 侵_vn 染_vn 过程_n 中_f 可以_v 激发_v 一些_m 小_a RNA_nx ，_w 在_p 相应_v 的_u 通路_n 中_f 发挥_v 作用_n ，_w 最终_d 增强_v 植物_n 抗病_vn 性_n 。_w</s><s>Zhao_nx 等_u [_w 44_m ]_w 通过_p 对_p 拟_vn 南_f 芥_n 进行_v 转录_vn 组_n 的_u 测_v 序_n ，_w 研究_v lncRNA_nx 表达_vn 谱_Ng ，_w 从_p 鉴定_v 出_v 的_u 6_m 510_m 个_q lncRNA_nx 中_f 进一步_d 分析_v 了_u 影响_v 开花_v 的_u lncRNA_nx 及其_c 作用_vn 机理_n 。_w</s><s>Ré_nx 等_u [_w 45_m ]_w 通过_p 对_p 低温_n 环境_n 中_f 的_u 拟_v 南_f 芥_n 种子_n 进行_v miRNA_nx 测_v 序_Ng ，_w 鉴定_v 出_v 低温_n 状态_n 下_f 独立_v 于_p HYL1_nx /_w SE_nx 产生_v 的_u 特定_b miRNA_nx ，_w 分析_v 其_r 与_p 低温_n 环境_n 适应性_n 的_u 联系_vn 。_w</s>
<s>5.4_m 单细胞_n 转录组_n</s>
<s>从_p 单个_b 细胞_n 水平_n 上_f 进行_v 转录_vn 本_n 研究_vn ，_w 能够_v 深入_ad 分析_v 细胞_n 之间_f 的_u 异质_n 性_n ，_w 从而_c 解析_v 不同_a 类型_n 细胞_n 的_u 生理_n 特点_n 。_w</s><s>对于_p 特定_b 组织_n 研究_v 其_r 功能_n ，_w 必须_d 要_v 了解_v 区分_v 其_r 细胞_n 类型_n 组成_vn ，_w 不同_a 的_u 细胞_n 类型_n 可能_v 发挥_v 了_u 特异_a 的_u 生理_n 功能_n 。_w</s><s>scRNA_nx -_w seq_nx 成为_v 深入_ad 研究_v 不同_a 类型_n 细胞_n 的_u 转录本_n 的_u 差异_n 以及_c 细胞_n 之间_f 的_u 组合_n 的_u 解决_vn 方案_n 。_w</s><s>目前_t 已经_d 有_v 多_a 种_q 方法_n 能够_v 实现_v 单细胞_n 分离_v 并_c 进行_v scRNA_nx -_w seq_nx 的_u 研究_vn 并_c 被_p 大量_m 的_u 应用_v 在_p 肿瘤_n 细胞_n 的_u 转录_vn 组_n 研究_vn 中_f [_w 46_m -_w 47_m ]_w 。_w</s><s>Moffitt_nx 等_u [_w 48_m ]_w 利用_v scRNA_nx -_w seq_nx 技术_n 对_p 大脑_n 中_f 的_u 不同_a 类型_n 细胞_n 进行_v 鉴定_vn ，_w 不仅_c 发现_v 了_u 之前_f 未知_v 的_u 神经元_n 亚_nz 型_k ，_w 结合_v MERFISH_nx 这样_r 的_u 空间_n 成像_vn 技术_n ，_w 还_d 允许_v 对_p 鉴定_v 出来_v 的_u 不同_a 类型_n 细胞_n 的_u 空间_n 分布_vn 进行_v 研究_vn ，_w 明确_v 不同_a 的_u 基因_n 在_p 不同_a 类型_n 的_u 细胞_n 中_f 表达_v 差异_n 。_w</s>
<s>6_m 展望_v</s>
<s>转录_vn 组_n 测_v 序_n 技术_n 能够_v 确定_v 信使_v RNA_nx (_w mRNA_nx ）_w 和_c 非_b 编码_n RNAs_nx (_w ncRNA_nx ）_w 序列_n 和_c 转录_vn 基因_n 的_u 结构_n ，_w 并_c 定量_v 的_u 动态_n 表达_v 每_r 个_q 转录_vn 本_n 在_p 不同_a 生物学_n 下_f 的_u 模式_n 条件_n 。_w</s><s>随着_p 测_v 序_Ng 技术_n 的_u 进一步_d 发展_v ，_w 为_p 转录组_n 的_u 定位_vn 和_c 定量_vn 的_u 研究_vn 提供_v 了_u 多_a 种_q 新_a 的_u 解决_vn 方法_n 。_w</s><s>总体来说_c ，_w 目前_t 的_u RNA_nx -_w seq_nx 仍然_d 以_p 基于_p 二_m 代_q 测_v 序_n 为主_v ，_w 基于_p 三_m 代_q 测_v 序_n 技术_n 进行_v RNA_nx -_w seq_nx 成为_v 转录_vn 组_n 学_n 研究_vn 的_u 一_m 个_q 重要_a 方向_n 。_w</s><s>目前_t 的_u 高_a 通_n 量_n 测_v 序_n 技术_n 都_d 需_v 经过_p 建_v 库_n 过程_n ，_w 即_v 首先_c 将_p 大量_m 的_u RNA_nx 分子_n 富_v 集_v 后_f ，_w 转化_v 为_v cDNA_nx 测_v 序_n 文库_n ，_w 并_c 在_p 建_v 库_n 过程_n 中_f 对_p cDNA_nx 分子_n 的_u 片段_n 连接_v 上_v 测_v 序_n 引_v 物_Ng 接头_n 和_c 样本_n 标记_n 序列_n 。_w</s><s>应用_v 最_d 广泛_a 的_u Illumina_nx 二_m 代_q 测_v 序_n 平台_n ，_w 采用_v 边_d 合成_v 边_d 测_v 序_n 的_u 策略_n ，_w 对_p 建_v 库_n 后_f 的_u 分子_n 进行_v 双_m 端_Ng 测_v 序_n 或_c 单_b 端_Ng 测_v 序_n 。_w</s><s>PacBio_nx 的_u 单_b 分子_n 实时_n 测_v 序_Ng 技术_n ，_w 具有_v 读_v 长_a 较_d 长_a 的_u 优点_n ，_w 能够_v 进行_v 全长_n 转录_n 组_n 的_u 研究_vn ，_w 特别_d 适合_v 用于_v 发现_v 新_a 转录_n 本_n 。_w</s><s>根据_p 实验_vn 目的_n 和_c 研究_vn 对象_n ，_w 基于_p 现有_v 的_u 测_v 序_Ng 平台_n ，_w 已经_d 可以_v 在_p 整体_n 水平_n 系统_a 地_u 开展_v 多_a 种_q RNA_nx 分子_n 的_u 研究_vn ，_w 除了_p 全_a 转录_n 组_n 和_c 全长_b 转录_n 本_n 的_u 研究_vn 外_f ，_w 单细胞_b 转录_n 组_n 的_u 研究_vn 是_v 近来_t 的_u 研究_vn 热点_n 。_w</s><s>随着_p 单细胞_n 分离_vn 以及_c 单_b 分子_n 测_v 序_n 技术_n 的_u 发展_vn ，_w 单细胞_n 转录_vn 组_n 测_v 序_n 技术_n 在_p 异质_n 性_n 细胞_n 的_u 转录_vn 组_n 研究_vn 中_f 具有_v 广阔_a 的_u 前景_n 。_w</s><s>RNA_nx -_w seq_nx 技术_n 的_u 发展_vn 为_p 从_p 整体_n 转录_vn 水平_n ，_w 细致_a 精确_a 地_u 研究_v 转录_vn 调控_vn 网络_n 与_p 性状_n 之间_f 的_u 关系_n 提供_v 了_u 有效_a 手段_n 。_w</s>
